前言

迄今为止，与传统的抗癌治疗策略相比，免疫治疗被认为是最有前景的全身性肿瘤治疗方法，在提高治疗效果方面发挥着不可或缺的作用，尤其是对难治性癌症的治疗。新兴的癌症免疫疗法包括癌症疫苗、嵌合抗原受体的T细胞（CAR-T）治疗、细胞因子治疗、免疫检查点抑制剂和双特异性抗体（BsAbs）。

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其中，双特异性抗体因其针对多个靶点的能力，已成为癌症治疗中一种关键和有效的治疗方式。然而，尽管FDA批准的第一种针对B细胞恶性肿瘤的双特异性抗体（blinatumomab）在临床上取得了成功，但仍存在许多障碍，如治疗耐药性和对实体瘤差强人意的效果。为了克服这些局限性，人们致力于开发多特异性抗体。截至2022年11月，约有20个具有三种（甚至四种）特异性的分子实体处于治疗血液系统恶性肿瘤或实体瘤的早期临床试验中。这些多特异性抗体的开发和应用，为解决癌症的复杂生物学和抗肿瘤免疫反应的发生开辟了新的途径。

多特异性抗体的设计

多特异性抗体通过同时结合不同的抗原或表位而表现出多重特异性，其大致分为两类：（a）IgG样（有Fc区）和（b）非IgG样（无Fc区）。

具有Fc区的IgG样多特异性抗体由于其较大的尺寸和FcRn介导的再循环过程，比没有Fc区域的多特异性抗体具有更长的循环半衰期。纯化更方便，溶解度和稳定性提高。更重要的是，它可能具有更大的临床治疗潜力，以保留多种Fc介导的效应器功能，包括抗体依赖性细胞毒性（ADCC)、补体依赖性细胞毒性(CDC)和Ab依赖性细胞吞噬作用。

非IgG样多特异性抗体相比之下，显示出相对较低的循环动力学，但具有更好的组织穿透能力，较低的免疫原性，以及较低的固有免疫系统的非特异性激活。这种形式的多特异性抗体主要依赖于其抗原结合能力发挥多种功能。

T细胞接合器（TCE）的多特异性抗体

免疫细胞接合器是能够重定向免疫效应细胞对抗癌症细胞的分子，其目的是触发有效的肿瘤细胞杀伤，充当免疫细胞和靶细胞之间的桥梁。Catumaxomab和blinatumomab是首个获批临床使用的T细胞接合器，均具有双特异性格式，并包括用于T细胞重定向的抗CD3部分。添加第三个结合域使T细胞结合器具有了新的功能，包括增强肿瘤特异性或增强免疫细胞激活。

增加第二个抗体结合部分以靶向相同肿瘤细胞上表达的不同TAA提供了额外的优势。与传统的单TAA靶向TCE相比，双TAA靶向可有助于防止由选择性压力引起的肿瘤逃逸，并可帮助克服抗原异质性。

双TAA靶向TCE已被设计用于白血病细胞杀伤，这是CD19/CD3 BiTE的进化形式。这种多特异性抗体在B-ALL患者中显示出显著的疗效。此外，为了克服潜在地CD19抗原逃逸，研究人员将第二种抗CD20 scFv添加到CD19/CD3 TCE中。在另一项工作中，通过将抗CD19 scFv和抗CD22 sdAb融合设计了CD19/CD22/CD3 TsAb。与单独或组合的相应BsAb相比，在B-ALL的患者来源的PDX模型中显示出显著增强的抗肿瘤功效。

NK细胞接合器（TCE）的多特异性抗体

靶向一个（或两个）激活NK细胞受体和TAA的多特异性分子构成了另一种免疫细胞接合器，其被开发用于增强NK细胞对肿瘤细胞的识别和杀伤。在激活的NK细胞受体中，触发静止NK细胞激活的能力上，CD16>NKp46>NKG2D。

与TCE一样，NKCE抗体中也实现了与两种不同TAA的同时结合，以增加其治疗窗口。例如，将额外的抗CD19 scFv添加到CD19/CD16的BsAb中。第二种肿瘤结合scFv的加入提高了对CD19+白血病细胞的亲和力，促进了NK介导的抗体依赖性细胞毒性，并改善了血清半衰期。另外，用TsAb CD33/CD16/CD123进行AML细胞的双重靶向，其诱导NK细胞对原发性白血病细胞的裂解能力明显强于三价BsAbCD123/CD16/CD123。

靶向两种共刺激或检查点受体的接合器

用抗CD3对T细胞的抗原非依赖性刺激已经被证实。然而另一方面，单价CD3诱导T细胞活化必须伴随着协同刺激信号，以实现最佳激活和T细胞增殖。此外，活化的T细胞反过来表达抑制性检查点受体以控制免疫反应。因此，三特异性TCE的设计，包括共刺激分子的激动剂或检查点受体的拮抗剂，以及抗CD3和抗TAA部分，构成了另一种策略。

这些分子包括共刺激受体CD28（TAA/CD3/CD28）的激动剂。研究发现，TsAb上抗CD28结构域的存在增强了体外不同多发性骨髓瘤（MM）细胞系的T细胞活化和杀伤，远高于daratumumab的效力。同样，TsAb在人源化的MM小鼠模型中表现得更好，即使在最低剂量下也是如此。基于同一平台的第二个TsAb HER2/CD3/CD28最近进入了临床试验。在人源化乳腺癌模型中，这种TsAb介导有效的肿瘤消退，即使在HER2表达较低的肿瘤中，也表明对目前不适合抗HER2治疗的乳腺癌症患者有潜在益处。

NK细胞的充分激活以诱导抗肿瘤免疫已被证明需要不同细胞表面受体的共同参与。基于这一考虑，已经设计了一系列结合TAA并触发两个NK细胞活化受体的分子。例如，TriNKET（三特异性NKCE疗法），DF1001是属于该平台的几种药物之一，其靶向HER2/CD16/NKG2D。这种HER2靶向TriNKET的安全性和有效性正在一项1/2期试验中研究，该试验针对各种晚期HER2+实体瘤患者，单独或与免疫检查点抑制剂联合使用。

另一种是多特异性抗体是基于IL-15的三功能NK细胞接合器，它用一个臂结合TAA，用另一个臂连接CD16，而它们的第三部分是IL-15，它通过与相应受体的相互作用激活招募的NK细胞。文献报道的第一个基于IL-15的TriKE是CD33/IL-15/CD16，它诱导了针对CD33+AML细胞系优异的NK细胞毒性、脱颗粒和细胞因子产生，并增加了NK细胞的体外存活和增殖。在小鼠肿瘤模型中，也显示出相对于BiKE增强的抗肿瘤活性。其他的TriKE还包括针对EpCAM、CD133以及CD19等。

靶向多种受体的多特异性抗体

除了免疫细胞接合器，另一种多特异性抗体识别在同一细胞表面表达的不同抗原，不会桥接肿瘤和效应细胞。

Amivantamab可识别EGFR和cMet并阻断其各自的信号通路，于2021被批准用于EGFR外显子20插入突变的非小细胞肺癌的治疗。在TsAb中掺入第三个结合结构域可能会提高其效力。例如，研究人员已经设计获得了HER2/EGFR/cMet的TsAb，TsAb被设计为具有不同的几何形状，每个构建体都表现出强烈的三特异性结合，它们的治疗潜力仍有待检测。

多重肿瘤靶向的另一个例子是针对EGFR、IGF1R和cMet或HER3的IgG样TriMAb。在将TriMAb活性与单个抗体或组合进行比较的增殖测定中，观察到EGFR/IGF1R/HER3 TriMAb更优异的生长抑制作用。另一种多特异性抗体GB263T，一种识别EGFR的IgG样TsAb和两种不同的cMET表位，具有增强的ADCC功能。在几种EGFR外显子20插入、EGFRC797S突变、cMET扩增和cMET外显子14跳跃突变的肿瘤模型中，GB263T的体内抗肿瘤效果显著。目前，GB263T正在1期临床研究（NCT05332574）中进行测试。

最后，人们也开始尝试基于TsAb的免疫偶联物进行药物、毒素或放射性同位素的肿瘤递送，从而潜在地增加选择性，从而增加其治疗窗口。

为延迟半衰期而设计的多特异性抗体

多特异性抗体的另一种形式包括增加血清半衰期的部分。包含白蛋白结合sdAb是小分子量治疗药物广泛使用的半衰期延长策略。由于白蛋白的大小和FcRn介导的再循环，其血清半衰期为3周，与标准IgG抗体相同。在临床前研究中，已经在不同物种中证明了通过与白蛋白结合的sdAb融合而延长抗体片段的半衰期。目前在临床试验中有相当比例的TsAb已经使用该策略延长了半衰期。

例如，分子量约为53kDa的单链TriTAC形式包含N端人源化抗TAA sdAb和C端人源性抗CD3 scFv，由抗白蛋白sdAb连接，这为TriTAC提供了延长的血清半衰期。截至2022年11月，四种TriTAC正在进行早期临床试验：抗BCMA的HPN217用于MM，抗DLL3 的HPN328用于小细胞肺癌（SCLC），HPN424用于前列腺癌症，HPN536用于间皮素阳性实体瘤。

Humabody CB307也采用了类似的策略，使用三种全人源sdAb靶向PSMA、CD137和HSA，目前正处于治疗晚期PSMA+肿瘤的I期试验。基于相同的技术，CB213是一种四价三特异性Humabody，同时在T细胞和HSA上接合PD1和LAG-3。与抗PD1单抗相比，CB213显示出优越的活性，以诱导来自NSCLC患者的T细胞体外增殖并抑制体内肿瘤生长。此外，NHP药代动力学表明可能每周进行一次临床给药，考虑到这些分子的小尺寸，这是一个有利的方案。

开发中的多特异性抗体

在过去的30年里，人们目睹了一个巨大的转变，从仅仅开发和改造基本的Abs，发展到更复杂的Ab衍生物、双抗以及最近快速发展中的多特异性抗体。目前，已有多项多特异性抗体处于临床前和临床开发阶段，下面的两个表格罗列了部分临床前和临床开发中的多特异性抗体。

小结

目前的临床前和早期临床数据表明，多特异性抗体相比双抗在增加免疫细胞的效力，针对肿瘤内异质性和不利的肿瘤微环境方面，具有更强的优势。同时，多特异性抗体在可制造性方面也提出了重要挑战，某些结构可能会受到稳定性的影响，导致断裂和聚集。此外，多链多特异性抗体的生产可能会受到由于错误组装而产生的非预期副产物的阻碍。这些问题都需要优化符合良好制造规范的工艺以解决。

参考文献：

1.When three is not a crowd: trispecificantibodies for enhanced cancer immunotherapy. Theranostics. 2023; 13(3): 1028–1041.

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